腫瘤源的細胞外小囊泡（TEVs, Tumor-derived extracellular vesicles）通過在親代細胞和受體細胞之間傳遞功能性生物分子，從而在癌癥的進展過程中發揮關鍵作用。

TEVs對于其他器官的影響已被不斷報道，這種效果主要是因為被包封的生物活性物質，包括脂質體、蛋白質、核酸和代謝物。一些研究解釋了TEVs的功能，包括腫瘤發生、轉移生態位的形成和影響免疫平衡。TEVs的分離對研究其生理功能及診斷和治療應用具有重要意義。

近期，來自武漢大學的科研人員以小鼠原發性乳腺腫瘤細胞為研究對象，提出了一種高效分離TEVs的新方案。這一方案通過差速超速離心法，僅用時4小時，就能從復雜的腫瘤細胞中提取出高純度的TEVs。這不僅為深入研究TEVs的生理功能提供了可能，也為癌癥的診斷和治療開辟了新的思路：

該方案包括了組織分離、酶消化和離心三步，該方案同樣適用于從其他類型的實體瘤中提取EVs。

申明：執行任何實驗方案都需要遵守當地機構關于實驗室安全和倫理的指導方針。

選對離心方案：差速超速離心！TEVs 的“提純術”

在將腫瘤細胞組織切片、分離和酶消化之后，對于關鍵分離步驟——離心部分的操作，研究人員用時4小時，通過多步差速離心的方式，依靠TEVs與雜質顆粒在大小和密度等不同參數的差異，將其分離出來。

為了獲得較高純度的TEVs并盡量提高收率，研究人員在離心操作過程中還分享了一些實用技巧和建議：

第一步離心：Eppendorf 5810R離心機，500 x g，20 min，4 ℃。

此步主要進行組織顆粒及細胞的沉淀分離，保留上清液。

第二步離心：Eppendorf 5810R離心機，3,000 x g，20 min，4 ℃。

此步目的是進一步去除組織碎片，保留上清液。

第三步離心：Sigma 1-14K微型離心機，10,000 x g，30 min，4 ℃。

此步的目的是去除較大細胞微泡（MVs）并富集小的TEVs，保留上清液。

• 取上清的操作要盡可能地快，以避免細胞沉淀再擴散。

• 可以在沉淀上方留下少量上清，以避免干擾上清。

• 取出的上清液需要用0.22µm孔徑的針頭濾器過濾，此操作中控制擠壓過濾器的力度非常重要，因為用力太大可能會導致也MVs穿過過濾器。

第四步離心：Hitachi Himac CP80WX超速離心機，P50A3轉頭，110,000 x g， 70 min，4 ℃。

此步是為了收集小的TEVs，保留沉淀。

• 選用新的超速離心管，在裝樣之前，建議先用清水清洗離心管后再用ddH2O充分沖洗，因為管子內部的涂層會粘附TEVs并阻礙其沉淀。

• 可選操作：如果需要進一步純化TEVs顆粒，可以將TEVs顆粒在2.5 mL PBS中重懸，然后將樣品緩慢加到0.5 mL蔗糖/重水墊液層之上，然后110,000 x g， 70 min，4 ℃離心。

第五步離心：Hitachi Himac CP80WX超速離心機，P50A3轉頭，110,000 x g， 70 min，4 ℃。

此步是將前步沉淀在1 mL PBS中重懸后再次離心，將TEVs顆粒進一步純化，保留沉淀。

• 離心后吸除上清時，建議在TEVs沉淀的對面進行操作，避免影響TEV沉淀。

經過上述操作之后，將最后所得的TEVs沉淀在冰冷的無菌PBS緩沖液中重懸，即可作為透射電鏡、免疫印跡和納米流式細胞術的測試樣品，可以對其進行進一步的鑒定和研究。

差速離心法分離TEVs是一種高效且高產的方法。然而與密度梯度離心、尺寸排阻層析、免疫沉淀和超濾等其他分離技術相比，該方法也存在一定的局限性。

1. 差速離心操作相對簡單，但并不適合一些痕量和珍貴樣品的研究。

2. 對于組織樣品，使用過濾裝置進行過濾操作是必不可少的，因為消化組織的成分包括一些復雜的囊泡干擾物，比如蛋白聚合物、細胞碎片和微生物。這些物質與TEVs尺寸相近，如果不進行過濾，將嚴重干擾TEVs后續的鑒定和生物學功能的研究。

3. 過濾操作也會影響TEVs的濃度，導致其產量下降。

本文所描述的EV分離方案針對乳腺癌（BC）細胞異位移植瘤進行了優化，并將小鼠三陰BC（4T1）異位移植瘤作為實驗模型進行了展示，在操作過程中也分享了一些可以獲得高純度EV和使收率最大化的實用技巧，對于其他類型的癌細胞異位移植瘤模型也具有參考價值。

CP-NX 系列超速離心機助力外泌體純化

日立HitachiCP-NX 系列超速離心機（本文 CP80WX 是上一代機型）憑借其出色的性能，可實現細胞外囊泡的精細純化。

隨著科研技術的不斷進步和腫瘤研究的深入發展，相信 Hitachi 超速離心機將在未來的癌癥診斷和治療中發揮更加重要的作用。